voopoo การแปรเปลี่ยนรูปเยื่อ การย้อมสีภูมิต้านทาน 

voopoo
voopoo

การแปรเปลี่ยนรูปเยื่อ voopoo การย้อมสีภูมิต้านทาน และก็การวิเคราะห์สำหรับ Iba-1 และก็ GFAP
ข้างหลังการกำจัด สมองทั้ง voopoo สิ้นได้รับการปรับปรุงตรงเวลา 48 ชั่วโมงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% (Sigma, St. Louis, MO) แล้วใส่ด้านในสารละลายซูโครส/พีบีเอส 30% (Sigma, St. Louis, MO) กระทั่งพวกเขาจะไม่สามารถที่จะลอยได้อีกต่อไป . แบบอย่า

ง ( n  = นำบุตรหลาน 6 3 M และ 3 F ต่อกรุ๊ปการดูแลรักษา) (บนน้ำแข็ง) ไปที่ Albert Einstein School of Medicine Histology Core เพื่อทำฝัง แบ่งส่วน การย้อมสี และก็กา

รเตรียมสไลด์ สมองถูกตัดตามแนวขวางรวมทั้งดัดแปลงเสมอๆเพื่อฝังน้ำมันก๊าด แบบอย่างถูกแบ่งส่วนไปยังพื้นที่ของฮิบโปแคมปัสแล้วก็เยื่อหุ้มสมองด้านหน้า แล้วก็ห้าส่วน (ดก 10 ไมครอน) ถูกเก็บรวบรวมเป็นพักๆโดยกั้นด้วยระยะห่าง 40 ไมครอน แต่ละส่วนถูกกำจัด

พาราฟฟิไนซ์ในไซลีนและก็ตามด้วยการบำบัดแอลกอฮอล์ที่จัดอันดับ ต่อจากนั้นแบบอย่างถูกนำกลับสู่ภาวะเดิมในน้ำ การดึงแอนติเจนถูกปฏิบัติงานใน 10 ไม่ลลิโมลาร์ โ

ซเดียม สิเตรต บัฟเฟอร์ ที่ pH 6.0 (Vector Labs, Burlingame, CA) ที่ 96 °Cตรงเวลา 20 นาที แล้วต่อจากนั้นวางสไลด์ลงใน Dako Cytomation Autostainer Plus (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) ในการย้อม การปิดล้อมทำเป็นโดยการฟักไข่ส่วนของเยื่อในซีรัมลาธรรมดา 5% ที่มี BSA 2% ตรงเวลา 30 นาที

แอนติบอดีพื้นฐานสำหรับกระต่าย Iba-1 (#019-19741, Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA) ถูกใช้เพื่อสำหรับการเจือจาง 1:500 แล้วก็โมโนโคลนัลแอนติบอดีสำหรับ GFAP (#835301, BioLegend, San Diego, CA) ยังถูกใ

ช้ที่การเจือจาง 1:500; เยื่อและก็แอนติบอดีเบื้องต้นเป็นลำดับของพวกมันถูกบ่มตรงเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิปกติ หลังจากนั้น ส่วนของเยื่อถูกบ่มตรงเวลา 30 นาทีด้วย I

gG ต่อต้านกระต่ายของแพะที่ถูกไบโอตำหนินิลเลต (#E0432, Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) ซึ่งตระเตรียมเจือจาง 1:250 ภายหลังจากการฟักไข่ตัวด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ ส่วนของเยื่อจะถูกบ่มตรงเวลา 1 ชั่วโมง (ที่อุณหภูมิปกติ) ด้วยการเ

จือจาง 1:200 ของ Streptavidin Alexa Fluor 555 และก็สารต้านเมาส์ Alexa Fluor 488 (#S32355 รวมทั้ง #A21202, Invitrogen, Carlsbad, CA) . จัดตั้งสไลด์ด้วย Prolong Gold Anti-fade reagent ด้วย DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) แล้วเก็บในที่มืดที่ –4°Cจนกระทั่งการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์

ภาพตัดขวางทั้งปวงโดนจับด้วยกำลังขยาย ×20 โดยใช้สแกนเนอร์สไลด์ปริมาตรสูง PerkinElmer P250 ( รูปที่ 1แบบอย่างภาพที่ผลิตมาจากสแกนเนอร์สไลด์) และก็นำเข้าโปรแกรมคอมพิวเตอร์สร้างภาพ Pannoramic Viewer การใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์สร้างภาพ Pannoramic Viewer ภาพของ cornus ammonis 1 (CA1), cornus ammonis 3 (CA3) และก็ dentate gyrus (DG) ของฮิบโปแคมปัส รวมทั้งรอบๆ frontal cortex ของส่วนทัลแต่ละส่วน โดนจับได้โดยใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์สร้างภาพ Pannoramic V

iewer รูปภาพสำหรับพื้นที่สมองแต่ละส่วนถูกนำเข้าไปยัง Volocity 6.3 ช่องสัญญาณ RGB ถูกแยกออก แล้วก็รูปภาพผล (ช่องสัญญาณ) สามภาพถูกรวมเป็นลำดับภาพสา

มช่องสัญญาณในการวัด โปรโตคอลการวัดที่เป็นมาตรฐานสำหรับพลเมืองเซลล์แต่ละกรุ๊ป (microglia, Iba-1 รวมทั้ง astrocytes, GFAP) ถูกทำขึ้นและก็ใช้สำหรับแต่ละพื้นที่ของสมอง และก็การประมาณลักษณะเดียวกับสไลด์ทั้งปวงจากพื้นที่นั้น เนื่องจ

ากว่าความเข้มของการเรืองแสงของ Iba-1 รวมทั้ง GFAP ไม่เหมือนกันในแต่ละพื้นที่สมอง โปรโตคอลการวัดที่ไม่เหมือนกันได้รับการพัฒนาสำหรับแต่ละรายการ (ละเว้น CA1 และก็ CA3) เพื่อควบคุมความต่างในโปรโตคอลการย้อมพื้นข้างหลังใน Velo

city เพื่อกรองขนาดของวัตถุที่รู้จักในการวัด สิ่งนี้ทำให้เกิดการลดความสว่างโดยรวมในสไลด์ด้วยการย้อมสีพื้นข้างหลังที่สูงขึ้น วัตถุประสงค์ของขั้นตอนนี้เป็นการปรับความ

เข้มของพื้นข้างหลังให้ปกติรวมทั้งลดความปรวนแปรที่เกี่ยวโยงกับความต่างของความเข้มของการย้อมสี สำหรับแบบอย่างรอบๆสมองแต่ละแบบอย่างที่ถ่ายรูปและก็พินิจพิจารณาใน Volocity 6.3 ข้อมูลสรุปจะถูกส่งออกรวมทั้งพินิจพิจารณาค่าความเข้มเฉลี่ยสำหรับ Iba-1 แล้วก็ GFAP สิ่งนี้นำมาซึ่งการลดความสว่างโดยรวมในสไลด์ด้วยการย้อมสีพื้นข้างหลัง

ที่สูงขึ้น จุดมุ่งหมายของขั้นตอนนี้เป็นการปรับความเข้มของพื้นข้างหลังให้ปกติแล้วก็ลดความผันแปรที่เกี่ยวโยงกับไม่เหมือนกันของความเข้มของการย้อมสี สำหรับแบบอย่างรอบๆสมองแต่ละแบบอย่างที่ถ่ายรูปและก็พินิจพิจารณาใน Volocity 6.3 ข้อมูลสรุปจะถูกส่งออกและก็พินิจพิจารณาค่า

ความเข้มเฉลี่ยสำหรับ Iba-1 และก็ GFAP สิ่งนี้ส่งผลให้เกิดการลดความสว่างโดยรวมในสไลด์ด้วยการย้อมสีพื้นข้างหลังที่สูงขึ้น จุดมุ่งหมายของขั้นตอนนี้เป็นการปรับความเ

ข้มของพื้นข้างหลังให้ปกติและก็ลดความปรวนแปรที่เกี่ยวกับความไม่เหมือนของความเข้มของการย้อมสี สำหรับแบบอย่างรอบๆสมองแต่ละแบบอย่างที่ถ่ายรูปแล้วก็พินิจพิจารณาใน Volocity 6.3 ข้อมูลสรุปจะถูกส่งออกแล้วก็พินิจพิจารณาค่าความเข้มเฉลี่ยสำหรับ Iba-1 รวมทั้ง GFAP